NK细胞在胃癌中的应答调控及作用研究

【摘要】胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率位居世界前列。胃癌的发生发展受到胃癌微环境中各种细胞相互调控的影响,其中免疫抑制性微环境的形成与胃癌的进展及病人的临床预后不良密切相关。在胃癌微环境中,除了肿瘤细胞和固有存在的间质细胞,还包括迁移到肿瘤微环境中来的免疫细胞。研究表明活化的免疫细胞及其效应分子在肿瘤组织中的增加通常预示着患者有较长的生存时间,同时缺乏T、B和NK细胞的重组活化基因2和白介素2受体双敲除(Rag2-/-I12rg-/-)小鼠亦可自发形成肿瘤并很容易诱导肉瘤。因此,肿瘤微环境中的免疫细胞与肿瘤的发生发展密切相关,增强机体免疫细胞的效应功能很可能成为胃癌免疫治疗的新策略。目前认为,CD8+细胞毒性T细胞(CD8+CTL)介导的获得性免疫应答在抗肿瘤免疫中占据主导地位,CD8+CTL在肿瘤微环境中的增加常提示患者预后良好。然而,课题组前期的研究显示CD8+CTL在胃癌微环境中受到一群由外周血趋化至肿瘤部位的髓样来源抑制性细胞的调节,从而导致CD8+CTL不能有效清除肿瘤细胞。近年来,NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用越来越受到关注。NK细胞不仅能够同CD8+CTL一样分泌颗粒酶、穿孔素和IFN-γ作用于肿瘤细胞,而且可以直接靶向识别并以抗体依赖的细胞介导的细胞毒性途径攻击肿瘤细胞,促使肿瘤细胞裂解死亡。尽管如此,在对已形成肿瘤如肝癌等患者和小鼠诱导肿瘤模型的研究中发现NK细胞的功能随肿瘤的进程明显受到抑制并与患者的临床预后不良相关。提示NK细胞功能的异常改变可能是导致肿瘤不断恶化的重要原因。那么,在胃癌微环境中NK细胞的功能是否受到抑制尚不明确。单核／巨噬细胞是一群浸润到肿瘤微环境中影响效应性淋巴细胞抗肿瘤应答的重要免疫细胞类型。目前认为,肿瘤活化的单核细胞是一群具有免疫抑制性的巨噬细胞,其可通过分泌免疫抑制性的因子或上调表达免疫抑制性的配体作用于淋巴细胞,从而调节淋巴细胞的增殖和效应功能。目前,在胃癌微环境中单核／巨噬细胞的免疫学特性和功能仍存在争议,并且其在胃癌中是否能够调控NK细胞的功能以及具体的调控机制还不清楚。
【作者】彭六生；
【导师】邹全明；
【作者基本信息】第三军医大学，临床检验诊断学，2014，博士
【研究目的】1.分析NK细胞在胃癌中的分布、受体表达及功能特征；2.探讨NK细胞在胃癌中的调控机制及其临床意义。
【研究方法】1.NK细胞在胃癌中的分布、受体表达和功能特征从重庆西南医院普外科收集了65例胃癌病人手术切除的组织标本和外周血，30例健康人外周血作为正常对照。H&E染色确立胃组织标本的病理学特征。利用流式细胞术、免疫组织化学染色技术检测NK细胞的分布情况。运用流式细胞术分析NK细胞表面受体和功能相关分子的表达情况。2.NK细胞在胃癌中的调控机制流式细胞术检测胃癌组织中单核/巨噬细胞的表型，免疫组织化学双重染色分析单核/巨噬细胞与NK细胞的共定位情况。购买重庆西南医院输血科的正常人外周血，免疫磁珠分选外周血CD14阳性的单核细胞。条件性外周血单核细胞由25%胃癌细胞系AGS细胞、胃癌组织和非肿瘤正常组织培养上清与外周血单核细胞共培养12小时所得。在共培养体系中，免疫磁珠分选纯化外周血NK细胞，再按照4:1的比例与同一个体的正常或条件性外周血单核细胞进行共培养，同时加入rhIL-2。在上述条件下或将NK细胞预先孵育抗2B4抗体30min，或直接加入抗TGF-β1抗体进行共培养，7天后收集细胞用于NK细胞表面分子染色，或加入PMA和离子霉素刺激以及Golgistop阻断蛋白转运4-6h，而后收集细胞流式染色检测内因子的表达，7-AAD/annexinⅤ凋亡检测试剂盒检测NK细胞的凋亡情况。此外，体外加入rhTGF-β1直接作用于NK细胞5天，收集细胞进行流式染色检测。3.NK细胞对胃癌病人预后的影响统计65例胃癌病人的临床信息，根据国际肿瘤分期标准进行临床TNM分期，胃癌病人的总生存率从手术当天算起，直到死亡或者最后一次随访。利用MannWhitney非参检验比较两组间的差异，单因素方差分析比较多组间的差异。Kaplan-Meier方法计算病人的累计生存时间,log-rank检验比较两组生存率的差异。采用GraphPadPrism5软件进行统计学分析和图形绘制，P＜0.05可认为存在统计学差异。
【研究结果】1.NK细胞在胃癌中的分布、受体表达及功能特征1.1流式染色结果统计分析显示：NK细胞、NKT细胞和T细胞在正常人外周血中的百分率分别为18.03%±1.82%、3.25%±0.38%和52.47%±2.56%，在胃癌病人外周血中的百分率分别为18.00%±1.67%、2.92%±0.40%和53.00%±2.08%；在胃癌病人非肿瘤正常组织中的百分率分别为4.41%±0.38%、0.93%±0.14%和16.24%±2.03%，在癌旁组织中的百分率分别为3.55%±0.25%、1.06%±0.15%和22.27%±2.09%，在癌组织中的百分率分别为2.38%±0.17%、1.29%±0.19%和29.82%±2.02%。独立T检验比较显示这三群细胞在正常人和胃癌病人外周血中的百分率无统计学差异，但在外周血中的百分率均显著高于组织标本中的百分率。在组织标本中，NK细胞在癌组织中的百分率显著低于癌旁组织和非肿瘤正常组织；反之，T细胞在胃癌组织中的百分率则显著高于癌旁组织和非肿瘤正常组织。进一步通过免疫组织化学染色发现，NK细胞在胃癌组织中的浸润较癌旁组织和正常组织少。1.2与正常外周血NK细胞相比，胃癌病人外周血NK细胞低表达活化型受体NKG2D、NKp30和DNAM-1。而在胃癌病人组织中，与癌旁组织和正常组织中的NK细胞相比，胃癌组织浸润的NK细胞低表达CD16，而NKp44和2B4的表达则有所增加。但另外两个自然杀伤受体NKp30、NKp46以及其他的活化型受体NKG2D、DNAM-1和CD94则无明显改变。此外，抑制型受体NKG2A、CD158a/h、CD158b和CD158e1在各组织NK细胞中所占的百分率也无统计学差异。1.3与癌旁组织和正常组织相比，胃癌组织浸润的NK细胞高表达细胞活化分子CD69，但与细胞增殖相关的分子Ki-67的百分率则明显较低，同时诱导肿瘤细胞凋亡相关配体TRAIL和细胞内因子IFN-γ的表达也显著下降。尽管穿孔素在肿瘤组织中并无显著变化，但是介导NK细胞脱颗粒的毒性功能分子CD107a在胃癌浸润的NK细胞中的表达却显著下降。2.NK细胞在胃癌中的调控机制2.1流式检测发现胃癌浸润的CD14阳性单核细胞共表达CD68，且高表达共刺激分子CD80，CD86和HLA-DR，同时上调表达CD16，Tie-2和CD163，提示其是一群被激活的具有免疫抑制性的巨噬细胞。相关性分析结果显示胃癌浸润的单核细胞与NK细胞成负相关。在胃癌组织中，免疫组织化学双重染色发现CD68阳性巨噬细胞与NK细胞存在相互接触的现象。2.2相比未经处理的单核细胞，胃癌细胞系培养上清作用后的条件性外周单核细胞能够促进NK细胞上调CD69分子的表达，但同时也能下调增殖和效应功能相关分子Ki-67、Perforin、TRAIL以及抑制IFN-γ和TNF-α的产生。NK细胞活性分析显示两组单核细胞诱导NK细胞凋亡的能力无差异。上述结果提示条件性单核细胞可促进NK细胞的活化，但是显著抑制了NK细胞的增殖和效应功能。2.3相比未经处理的单核细胞，胃癌细胞系作用的条件性外周单核细胞并不上调CD48、PD-L1和PD-L2以及CD155和CD112分子的表达，流式细胞术检测胃癌组织和正常组织中CD48、PD-L1和PD-L2以及CD155和CD112在单核细胞的表达也无统计学差异。在外周NK细胞与胃癌细胞系作用的单核细胞共培养体系中，预先孵育抗2B4抗体阻断CD48/2B4信号不能有效逆转单核细胞对NK细胞的抑制。但加入抗TGF-β1抗体后则发现NK细胞的功能得以恢复。此外，利用胃癌组织培养上清作用的单核细胞也能够显著抑制NK细胞表达IFN-γ和TNF-α，加入抗TGF-β1抗体后则能够恢复NK细胞的功能。进一步体外直接加入rhTGF-β1可导致NK细胞下调Ki-67和IFN-γ的表达。上述结果表明TGF-β1信号在肿瘤活化的单核细胞抑制NK细胞的功能中发挥了重要作用。3.NK细胞对胃癌病人预后的影响胃癌组织大于5cm或肿瘤侵袭晚期的病人肿瘤中NK细胞的百分率显著低于胃癌组织小于5cm或肿瘤侵袭早期的病人，有神经侵袭、淋巴结和远端转移的病人肿瘤中NK细胞的百分率显著低于没有神经侵袭和淋巴结及远端转移的病人。进一步TNM分期显示胃癌病人癌组织、癌旁组织和非肿瘤正常组织中NK细胞的百分率随胃癌的进展均逐渐下降，但癌组织中的NK细胞百分率与胃癌的进展成显著负相关。根据胃癌组织中NK细胞百分率的中位数(2.36%)将病人分为高、低两组，随访时间为20个月。通过对病人的生存率进行统计分析发现高NK细胞百分率的病人组生存率显著高于低NK细胞百分率的病人组。
【结论】1.与T细胞在胃癌中浸润增加相反，肿瘤内NK细胞的百分率显著低于癌旁组织和正常组织。尽管NK细胞表面的活化型受体和抑制型受体并没有明显改变，但其功能在胃癌微环境中显著下降。2.肿瘤活化的单核细胞可诱导NK细胞功能的下降，其调控机制是通过TGF-β1而非CD48/2B4信号途径。3.肿瘤内NK细胞的百分率与胃癌的进展密切相关且高于NK细胞百分率中位数的病人总体存活时间较长。
【关键词】NK细胞；胃癌微环境；免疫调控；肿瘤进展；

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